锐谈 「 Metab. Eng：代谢改造谷氨酸棒杆菌高产戊内酰胺
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- 发布时间：2023-08-07 17:08
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戊内酰胺（VL）是一种五碳（C5）内酰胺，可作尼龙-5和尼龙-6,5的前体。Taehee Han等人以谷氨酸棒杆菌为底盘，通过代谢工程改造主要产生VL产物，在基因组中筛选和改造了假定的5-氨基戊酸（5AVA）转运蛋白基因，可重新摄取排泄的5AVA，此外，多拷贝act基因整合到基因组中也加强5AVA向VL的转化。最后再通过增强葡萄糖摄取系统的构建，最终获得的VL10（pVL1）菌株，在烧瓶培养中产生9.68 g/L的VL。
主要研究内容包括：
1. 实验了Corynebacterium glutamicum BE 菌株的 VL 耐受性
作者研究了C. glutamicum BE菌株对VL的耐受性。发此刻60 g/L的VL下，细胞滋长受到严重抑制。
2. 设计与构建了VL生物合成途径
作者使用L-赖氨酸衍生物路线构建VL生物合成路线，含有来自腐臭假单胞菌的暗码子优化后的davAB基因用pGA1质粒引入C. glutamicum BE菌株中，L-赖氨酸已成功转化为5AVA。使用act 基因增加his标签后克隆到pEKEx1中。且davAB和his标志的act基因构建在同一质粒中，可减轻两个质粒对宿主菌株的负担负责，表明了谷氨酸梭菌中异源VL生物合成路线的成功成立。
3. 增加 VL 通量
作者前期在C. glutamicum BE菌株中引入了 11 种基因组装饰，明确增强了L-赖氨酸通量，而VL生物合成利用的前体L-赖氨酸。作者在此菌株基础上，敲除了gabT基因补充了 VL 产量程度。别的，作者利用小RNA技术，敲除了三个基因。菌株在 42 小时内发作 8.83 g/L 的 VL。然而，观察到在发酵中发作了大量的5AVA。
4. 筛选和改造5AVA 转运基因
作者通过敲除NCgl0464 基因，添加了5AVA滴度。发觉NCgl0464 基因编码5AVA导入，负责5AVA摄取到细胞中。
5. 将通路基因的多个拷贝整合到基因组中
增加act 基因到三个拷贝数，增加了VL的产量。
6. 增强葡萄糖摄取系统
末了通过过表达肌醇渗出酶和葡萄糖激酶基因加快了葡萄糖摄取，促使细胞更快成长，增加VL的产量。
菌株VL10 菌株在补料分零售酵的 76.1 小时内爆发 VL 的最终产量达到 76.5 g/L。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ymben.2023.07.002
