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锐谈 「 ACS Synth. Biol：来自解淀粉芽孢杆菌的酚酸反响转录因子的鉴定、表征及工程改造

锐谈 「 ACS Synth. Biol：来自解淀粉芽孢杆菌的酚酸反响转录因子的鉴定、表征及工程改造

  • 分类： 新闻动态
  • 作者：桃子
  • 来源：
  • 发布时间：2023-09-08 15:40
  • 访问量：

锐谈 「 ACS Synth. Biol：来自解淀粉芽孢杆菌的酚酸反响转录因子的鉴定、表征及工程改造

【概要描述】

  • 分类： 新闻动态
  • 作者：桃子
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转录因子的生物传感器用于代谢工程中基因表达的诱导控制以及干系应用，比方高通量筛选和动态调控，于是挖掘新的转录因子至关重要。PadR是一种酚酸反应性转录抑制因子，在枯草芽孢杆菌中发现，PadR不妨抑制启动子PpadC及其下游编码的酚酸脱羧酶基因的表达，当细胞泄漏于酚酸积累的情况中时，酚酸会与PadR连络，导致PadR构象爆发变化，解除对padC转录的抑制，激活酚酸的脱羧效用。由于该调节器可以检测对香豆酸、阿魏酸等重要酚酸化合物，于是其当作代谢工程和合成生物学中的生物传感器被广泛查究和探索。
近来，美国佐治亚大学闫亚军团队在ACS Synthetic Biology上发表了名为“Identifying, Characterizing, and Engineering a Phenolic Acid-Responsive Transcriptional Factor from Bacillus amyloliquefaciens”的文章。该研究发觉了来自解淀粉芽孢杆菌中的新式酚酸响应转录因子BaPadR，揭示了其配体特征，并通过BaPadR调节器的定点诱变和BaPadR连络盒的碱基变换扩大了其动态界线并提高了其灵敏度，扩展了此刻小分子传感转录因子库，并为生物传感器工具箱作了有用增补。
闫亚军团队基于对枯草芽孢杆菌的BsPadR的深度考究，找到了解淀粉芽孢杆菌中对应的BaPadR序列以及BaPpadC启动子的序列，随即在大肠杆菌中重修了BaPadR-BaPpadC传感器体系。BaPadR构建在pCS27中IPTG诱导型的pLlacO1启动子上，BaPpadC启动子用于控制汇报基因egfp的表达，天生pCS-BaPadR和pHA-BaPpadC-WT-egfp双质粒，并转入大肠杆菌。
结果证明，BaPpadC启动子的活性低，且对BaPadR和p-香豆酸异国任何响应，他们猜度没关系是由BaP padC启动子上的天然RBS 活性较低所致，补充强RBS后BaPpadC-RBS展现出高活性。但是当BaPadR表达被0.5 mM IPTG诱导时，启动子活性急剧着落，且补充p-香豆酸也不能解除这种抑制，他们猜度没关系是由于PadR的高表达程度所致，是以，为了镌汰BaPadR表达，他们通过微调IPTG浓度调解 pLlacO1启动子的活性，证明了该传感器体例的成功重建并验证了BaPadR的功能，且当IPTG浓度设置为2.5 μM时，600 mg/L p-香豆酸可能释放近60%的抑制。
，他们团队解析了该传感器编制的配体界线，而且通过与BsPadR进行序列对比发觉，BaPadR中底物连络地域存在分别的氨基酸序列，所以他们猜想BaPadR可以具有分别的配体谱。确定p-香豆酸具有最好的诱导效果，600 mg/L的p-香豆酸可以导致egfp的表达程度添补3.36倍，其次是阿魏酸、水杨酸和咖啡酸。
查究结果可知补充酚酸类化合物不能合座解除BaPadR对BaPpadC启动子的按捺，他们猜想BaPadR的高按捺效率可能是因为BaPadR与启动子BaPpadC之间的高结合亲和力所致。他们基于对BsPadR的DNA结合区域进行工程设计的查究根源，对BaPadR设计并构建了六个BaPadR突变体，其中S39A 变体BaPadR-BaPpadC生物传感器体例使动态界限增加了1.71倍，而且对最佳突变体S39A进行了底物界限的实验，p-香豆酸仍然呈现最佳，在600 mg/L诱导剂浓度下，导致egfp表达程度增加7.55倍，其次是阿魏酸、咖啡酸、水杨酸和肉桂酸。

除此之外，闫亚军团队通过启动子截短和混合启动子构建鉴定了潜在的 PadR在BaPpadC启动子中的DNA联络盒。
对比BsPadR的DNA联络序列，找到了BaPadR的潜在DNA联络序列
（BaPadR-1：“-CATGTAAATAGTTACATG-”，
BaPadR-2：“-CATGTATATAATAAACATA-”）

他们设计了四个截短的开动子，试验袪除潜在的连络序列后开动子是否可能反响BaPadR和p-香豆酸，终极证实了两个负责与BaPadR识别的DNA序列，并且BaPadR-1为主要的鉴别和连络序列。

验证BaPadR连络盒的功能并查究这两个DNA连络序列是否可以以“即插即用”的方式利用，他们试图通过连络序列插入不能被调控的启动子中来设计混合启动子，用BaPadR连络盒取代LacO的地方1和2使BaPadR分辩杂合启动子并抑制下游汇报基因的转录。通过在差异地方替换两个连络盒，设计了四个混合启动子，同时为了考虑到两个BaPadR连络盒在原始启动子中是重叠的设计了两个额外的杂合启动子。

结果说明，BaPpadC启动子表现出比pLlacO1启动子高的活性，说明其在合成生物学和代谢工程中的应用具有巨大潜力，同时Phy12保持了与pLlacO1相当的启动子活性，而且BaPadR没关系按捺Phy1282.8%的启动子活性。补充600 mg/L p-香豆酸后，启动子活性可回复复兴29.7%。
除此之外，他们实验了六个混合启动子对S39A变体的动态职能BaPadR对Phy12和Phy21启动子的按捺效率变为77.4%和49.2%，但这两个启动子对对香豆酸的反应得到改善。通过 600 mg/L的p-香豆酸诱导，能够规复大约 63.4% 和 68.5% 的启动子活性。

BaPadR结合盒的表征，他们但愿降低调节子和开动子之间的结合亲和力，并查究结合盒中核苷酸调换对整个传感器体例输出的影响。他们基于对BsPadR的查究，对BaPadR的BaPadR-1结合序列的C6、T8和T18进行单碱基突变，并获得了多个碱基突变的开动子，最终PpadC-T18C、Phy12-C6A和 Phy12-C6T不妨被600 mg/L的 p-香豆酸举座诱导。

原文链接：https://doi.org/10.1021/acssynbio.3c00206

作者：桃子

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