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丝状真菌产生的嗜氮酮类化合物（MAs）在食品和制药工业中表现出巨大的潜力，然而，野生型菌株的低产量和丝状真菌的基因编辑等方面存在着严重的瓶颈。

本查究中，红曲霉HJ11通过启动子工程、基因敲除、限速酶过表达、竞争路线按捺、酶工程和代谢平衡的组合进行了系统代谢工程设计。MAs产量的最大产量和滴度分别胜利的提高到906 mg/g DCW和14.6g/L。本查究的胜利模式不单为提高MAs的产量供应了一条实用有效的路线，并且揭示了系统代谢工程的潜力。

1. 鉴定MAs生物合成途径中的限速步骤

利用靶向代谢组学确定MAs产量与丙二酰辅酶A、乙酰辅酶A、丙酮酸和1，6-二磷酸果糖的关连性显著。

2.碳源依赖性启动子的比较与选择

差别用PgpdA，Pfba，PtrpCm，PtrpC，Ptef1，PamyB，Pxylp，Pmt2过表达pigB。

3.通过下调 mrgltA PYR 通量重定向到丙二酰辅酶 A

TCA轮回淘汰PYR通量能够会添加用于MAs生物合成的丙二酰辅酶A通量。在菌株中敲除线粒体基因mrgltA，但该菌株的滋长速度降低，这能够限制MAs的爆发，因而运用弱启动子PtrpCm替换降低mrgltA表达量。

4.糖酵解途径关键步骤的工程设计

来自黑曲霉的PYK基因pykA，在Ptef1的控制下异源表达，来自黑曲霉PFK基因，在Ptef1的控制下异源表达。

5.在LA旁路途径中敲除乳酸脱氢酶基因，以促进丙二酰辅酶A供应

重组菌株的LA含量显著提高，LA由LDH从PYR天生，于是敲除LDH基因。

6.通过过表达PDH基因进行乙酰辅酶A生成工程

PDH门路是通过PDH多酶复合物从PYR直接变成乙酰辅酶A，包含三种大肠杆菌酶：LpdA AceE AceF，引入工程菌株PM11。

7.通过过表达ACC基因增强丙二酰辅酶A供应

工程菌株PM13中过表达，丙二酰辅酶A水平分明增加，乙酰辅酶A水平分明降低。

8.通过下调脂肪酸合酶基因抑制比赛脂肪酸生物合成

FA和MA的生物合成呈现出正关联关系，脂质含量随着丙二酰辅酶A程度的增补而增补，FAS的原始启动子被弱启动子PamyB, PtrpCm, Pfast 取代。

9.在下游途径中引入异源 AzaH

MrPigN，AzaH和AfoD呈现出相似的底物特异性。在菌株中表达了mrpigN，azaH和afoD。引入异源AzaH导致高的MAs产量。

10. AzaH的酶工程

定点诱变揭示了对催化效率至关重要的六个通道残基。

11.用于高产量MA的两阶段发酵策略

应用两阶段发酵策略，其中葡萄糖和蔗糖先后用作碳源，在早期-中期使用葡萄糖算作MAs生物合成的抑制剂促进细胞成长，并在中后期细胞密度较高的本原上激活MAs生物合成和蔗糖算作诱导剂。

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.1c07588

作者：末一