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深度突变扫描可提供全面的序列功能相关图，成为蛋白质工程改造中确定功能热点的灵验办法。来自塔夫茨大学化学与生物工程系的NikhilU. Nair教学团队在DMS引导下设计野生型苯丙氨酸解氨酶，构建了一系列突变体并评估特定的突变何如战胜催化过程中限制活性的步骤。

1、AvPAL的DMS

作者对AvPAL进行随机突变获得了Naive文库，并传代了3次。，作者基于先前在大肠杆菌中斥地的生长偶联富集主意对AvPAL进行DMS，获得其序列-功能图谱。通过火析，作者发觉活性位点残基，包括负责催化和底物连络的残基，通常不允许突变发生「图1d和e」。因此，与活性位点残基关系的DMS数据解析的很多结果与发表的PALs数据在很大水平上是的，且适应度得分与酶的催化活性具有很高的关系性。

2、序列-功能表征识别突变热点

作者计算了适应度梯度以识别突变热门，适应度梯度是通过计算于Naive文库的每个地点上每个突变的适应度确定的。确定了适应度梯度最大的一十二个地点 「图2a」。从组织上看，最符合的突变聚集在蛋白质链的两端「图2b」。作者进一步计算了每个残基的α-碳与停靠在同一链活性位点的Phe α-碳的距离「图2c」，发现大都有益突变距离同一链的活性主旨较远而挨近相近链的活性主旨 「图2d」。

3、组合突变

前面的解析，作者选取了七个热门位置「102,218,222,268,306,360和453」进行研究「图3e」。这些残基分类为包孕两个地域: 「i」位于活性位点「268,306,360和453」四周的环内的残基「图3f 」和「ii」聚集在活性位点表面的 α-螺旋内的残基「102,218和222」「图3g」。

辨别有益突变体，作者使用七个热点构建了包含一个，三个，七个位点突变的组合突变库，然后计算每个残基的适应度。7C1文库中所有位点都有有益突变，而7C3 和7C7 文库中少的突变是的。这证明，尽管很多单点突变有利于提高适应度，但大多数突变不会起到协同功用。

总之，作者运用DMS供应了AvPAL的详细序列-功能景观，确定了七十九个功能相关的改善活性的位点，并选择了七个热门进行单点或多点饱和突变，有效提高了AvPAL的催化活性，证明了DMS策略在卵白质工程中的重要应用。

原文链接：https://doi.org/10.1021/acscatal.1c05508

作者：Candy