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锐谈 | PNAS: 强启动子的合成设计方案

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发布时间：2023-10-16 10:09
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锐谈 | PNAS: 强启动子的合成设计方案

【概要描述】

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启动子元件的有效活性是限制人工遗传系统发展的主要影响因素。例如，基于DNA的shRNA系统由更强启动子驱动时能够表达出更高水平。目前使用的许多强启动子在不同的细胞背景下具有高度可变的转录水平，并且在许多细胞系中表达较少或不表达。这限制了功能丧失和功能获得。对于此，作者提供了一种强启动子的合成设计方案，通过合成生物学的方法来筛选人类细胞中转录因子的结合位点活性。

在Nimblegen微阵列上打印寡核苷酸，生成了含有一十个序列的合成增强子库。在阵列上打印的每个序列由10个10- mer序列组成，以产生一个100-mer的寡核苷酸，该寡核苷酸的两头差别有限制性酶切和引物结合位点。每个100-mer包括一十个差别的10-mer序列。

微阵列上切割出约5Mb的寡核苷酸并进行pcr扩增，然后限制性克隆到载体pSJ2中，并通过逆转录病毒载体使单个构建体整合到细胞。当在低习染多重性「MOI」下利用时，裁减了会杂沓开动子多重整合的产生。EGFP为最小CMV开动子的总体转录程度供应了一个标志，没关系很便利的通过FACS检测。利用自灭活载体没关系防范开动子受到病毒LTR的干扰，后者包括3 ' LTR的缺失，导致逆转录病毒开动子在整合到基因组中时合座失活。MCS被设计成包括多个具有兼容末了的限制性位点，用于同时插入多个增强子，这在后来的组合实验中变得很重要。比喻，EcoRI- xhoi增强子片断没关系被重新克隆到MfeI-SalI或EcoRI SalI中以进行双插入。增强子没关系当作BamHI-EcoRI片断切除，并插入到BglII-MfeI切割片断中。

试验运用10-mer序列文库筛选增强子元件的可行性，屡屡序列的质粒文库被包装成逆转录病毒，传染到HeLa细胞上。这导致库中存在很多较弱的增强子。尽管最小的CMV开动子的转录水平不明晰高于未传染细胞，但含有增强子的HeLa细胞上的FACS展现，超越15%的10-mer屡屡文库插入物可能提高CMV开动子配景水平的转录增强。不到1%的细胞可能GFP表达水平驱动到WT CMV增强子驱动构建体的鸿沟内。第三轮筛选完成后，剩余插入物进行pcr扩增并克隆为质粒文库。对证粒DNA进行测序。测序展现，很多克隆含有高度相似的序列，代表了几种主要的转录因子结合位点。回收的主要克隆类的个别代表被包装成逆转录病毒并传染到细胞中。在这些个体克隆中复原了多种增强子强度。强度鸿沟从特殊低的增强剂到与WT CMV增强剂的增强剂活性。在池中复原了多个相干但区别的序列，支持了筛选的可屡屡性。