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异戊烯醇是生物燃料中的一种，异戊二烯等商品化学品的前体。

此刻已知在大肠杆菌中通过甲羟戊酸道路道路生产异戊烯醇，产量为理论最大值的70%。

本文基于甲羟戊酸二磷酸脱羧酶的混同活性斥地基于IPP旁路的异戊烯醇路线。

一．MVA途径及不足

一分子MVA由两步磷酸化转变为一分子MVAPP，消耗两分子ATP，颠末脱羧酶PMD生成一分子IPP，消耗一分子ATP，图。

综上通过MVA途径生产一分子IPP必要消耗三分子ATP，同时IPP水解时磷酸基团会被白费，同时IPP积累会按捺大肠杆菌发展。

MVA途径因为异戊烯基二磷酸的毒性，及ATP的高需求量，提高产率。

二．IPP旁路途径

文章改进：本文改用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（PMD）的混杂活性开发基于IPP旁路的异戊烯醇途径。

采用异源表达酿酒酵母PMD酶脱羧MVAP变成磷酸异戊烯基（IP」,此道路可以降低IPP毒性，并降低ATP的消耗，图「B」。

同时PMDsc对非天然底物MVAP的活性低，是以需构建PMD的突变菌株，提高活性。

三．构建筛选平台

将宿主菌株生长速率与PMD酶脱羧速率耦合，筛选PMD突变体。

方案：

1. 在栽植基中补充MEP途径按捺剂Fosmidomycin，按捺MEP途径，阻断发作IPP和MAPP的独一途径，图「B」。

2. PMDsc的混同酶活性，与IPP、二甲基焦磷酸烯丙酯DMAPP的形成相耦合。

3. 增补抑制MEP途径的抗生素排除内源性MEP途径爆发的IPP，只有异源IPP旁路的表达大肠杆菌本事滋长。

步骤1：

对比报道中三种对IP有活性的激酶EcIPK、MtIPK、TaIPK在DH1菌株野生型中表达，对比得出MtIPK活性最高。

结论：优化了大肠杆菌DH1只能从由MVA路线旁路路线中爆发的IPP中存活，验证了细胞生长依赖于异源表达的IPP旁路中MVAP的脱羧反响。

(图a)

步骤2：

三种PMDsc突变体的动力学测定，R74H突变体活性最佳，同时成长速率。

结论：发展速率依据MVAP脱羧活性和PMDsc的表达程度而变化。

(图b)

四．筛选平台的应用

构建好全体筛选平台的底层菌株后，对PMDsc构建酶文库，验证多种差别的PMDsc突变体在构建好的筛选平台条件下酶活性、菌株滋长速度与产物滴度具有一定的相干性，「表2」。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ymben.2017.03.010

作者：祭